产品目录

本制品是基于phi29 DNA聚合酶的滚环扩增试剂盒，配备的Modi-phi29 DNA聚合酶具有链置换和连续合成特性，可连续合成长达70kb的DNA片段。另外，该酶具有3'→5'外切酶校读功能，合成的DNA片段保真性高。配备的Random Hexamers为6碱基随机引物可对目标分子进行指数放大（通常放大100～10000倍），特殊的实验可自行搭配相关引物。

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是近几年发展起来的一种核酸恒温扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。因其高灵敏度、高特异性和可操作性，RCA技术在基础研究、实际检测、医疗诊断及纳米材料等方面都有很好的应用，结合细胞原位检测、单核苷酸多态性SNPs，蛋白质分析、免疫芯片和全基因组的扩增等研究都能发挥其巨大的优势。

以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在phi29 DNA聚合酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。

• RCA扩增是利用phi29 DNA聚合酶链置换活性和持续合成能力的特性，对环状模板进行放大扩增。因此，其最佳底物为环状ssDNA或dsDNA模板。除此外，其对分子量较大的线性模板同样可以持续合成和放大扩增，如基因组DNA，此时其扩增放大比例弱于环状DNA的扩增。
  
• 由于RCA扩增中使用随机引物进行放大，在加入高浓度的随机引物时，容易导致引物自身的扩增（假阳性）。因此，建议针对不同类型、浓度的模板底物，采用不同的引物扩增浓度和扩增时间来控制假阳性扩增。
  
• RCA扩增还可应用于其它缺刻或诊断相应的实验，此时Random Hexamer为非必须品。

• 配制引物、模板退火体系
  

  成分	用量
  模板DNA	0.01～40ng
  10×phi29 Buffer	2μL
  10mM dNTP	1.2μL
  Random Hexamer	1～10μL
  ddH2O	至19μL

• 引物和模板退火：体系配制完毕后，放置到PCR仪中，95℃ 3min，25℃ 3min。
  
• 退火完毕后，向退火产物中加入1μL Modi-phi29 DNA聚合酶(10U/μL)，混合均匀。
  
• 扩增反应
  
  • 变温扩增：
    对于所有类型的模板，在相同的时间条件下，变温扩增，始终具有更高的灵敏度和产量，推荐使用变温扩增反应。在PCR仪上做如下设置：
    
    【30℃ 5min；42℃ 15s】循环35次（约3h）或44次（约4h）
    • 必要时，反应结束后，可于65℃ 10min进行失活反应。
  • 恒温扩增：
    对于变温反应不能满足扩增要求的实验类型，仍然可以采用传统的30℃恒温扩增，30℃孵育3-6h。过长的孵育时间会增加扩增产物量，但同时可能会导致非特异扩增。

图1.以质粒DNA为模板，采用变温高产、快速程序扩增4h，可扩增出10pg的质粒。	图2.RCA扩增后的质粒(4.8kb)进行限制性内切酶消化，单酶切产物为4.8kb，双酶切产物为1.5kb和3.5kb。	图3.以基因组DNA为模板，采用高温高产、快速扩增程序扩增4h，可以扩增出10pg的基因组DNA。